SẢN PHẨM HỖ TRỢ UNG THƯ TỪ THẢO DƯỢC - KACIMEX

TÁC DỤNG CỦA KACIMEX

ĐỐI VỚI UNG THƯ GAN THỰC NGHIỆM Ở CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC VỚI HỆ THỐNG MIỄN DỊCH CỦA CHUỘT MANG U

          Prof.Huangren Bin.PhD *; Dr Nguyen Phu Kieu PhD ** Prof. PhamKim Man,PhD**

         *Viện dược lý lâm sàng -Đại học y khoa Naning-China.

         ** Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo Việt Nam.

I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Vật liệu

1.1. Các loại thuốc và hóa chất thí nghiệm:

- Kacimex, thuốc do Công ty TNHH Quế Lâm, Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo Việt Nam sản xuất.

- Cyclophosphamide, thuốc do Công ty Hằng Thụy, Giang Tô sản xuất, số hiệu 06041521

- 5-fluorouracil

- Di methylthiazole, sản phẩm của Công ty Sigma, Hoa kỳ sản xuất

- Môi trường RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), sản phẩm của Công ty Hyclone sản xuất

- Huyết thanh bê tươi, sản phẩm của Công ty Tứ Quý Thanh, Hàng Châu sản xuất

1.2. Máy móc thiết bị:

- Máy đọc ELISA tự động, Dụng cụ pha dịch vi lượng, Kính hiển vi đảo ngược đối pha.

- Tủ cấy CO₂

- Buồng cấy siêu sạch

- Tủ lạnh sâu

1.3. Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng, thể trọng trung bình 18-22g, đực cái mỗi loại một nửa, do trung tâm nuôi súc vật thí nghiệm, Trường Đại học Y Khoa Quảng tây cung cấp. Số hiệu phê chuẩn: Quế SCXK-2003.

- Dòng tế bào ung thư gan chuột H₂₂, 3 dòng tế bào khối u ở người 7404, SGC-7901, HEPG₂ do Viện Dược, Trường Đại học Y Khoa Quảng tây cất giữ.

2. Phương pháp

Dùng phương pháp so màu MTT với Di methylthiazole để xác định tác dụng ức chế khả năng tăng sinh tế bào của thuốc Kacimex

            Dùng peptidase xử lý 3 dòng tế bào khối u ở người 7404, SGC-7901, HEPG₂ khi đang phát triển ở thời kỳ bội số, sau đó dùng môi trường RPMI-1640 thêm 10% huyết thanh thai bò tươi điều chế thành huyền dịch tế bào có nồng độ 10⁷ tế bào/ml, cho vào tấm nhựa nuôi cấy loại 96 lỗ, mỗi lỗ 190 µl, ủ ở buồng cấy 5%CO₂, 37^oC, độ ẩm 95% trong 8 giờ. Thiết kế mẫu thành:

            - Nhóm đối chiếu: chỉ cho thêm 5- fluorouracil

            - Nhóm chứng: chỉ cho thêm môi trường RPMI-1640

            - Nhóm thí nghiệm: phân biệt cho thêm các nồng độ khác nhau 5- fluorouracil và thuốc Kacimex

            Nuôi cấy 48 giờ, thêm 10µl xanh Thiazole (5g/L), tiếp tục nuôi cấy thêm 4 giờ nữa ở cùng điều kiện trên, nhanh chóng lật ngược tấm nhựa nuôi cấy để loại bỏ dung dịch nuôi cấy ở trong các lỗ, mỗi lỗ cho thêm 150µl DMSO (Dimethyl sulfoxide), lắc nhẹ bằng máy lắc khoảng 10 phút trong bóng tối ở nhiệt độ phòng để kết tủa hoàn toàn tan ra, dùng máy đọc ELISA tự động bước sóng từ 570-630nmnddeer đo trị số OD của thành phần trong các lỗ, tính toán tỷ lệ ức chế.

Tỷ lệ ức chế (%) = (1 – Trị số OD nhóm thí nghiệm/Trị số OD nhóm đối chiếu) x 100

Tính toán số IC₅₀ (Inhibitory concentration 50%)

3. Thí nghiệm trên động vật

3.1. Ảnh hưởng của Kacimex lên tác động gây ung thư gan thực nghiệm (H₂₂) ở chuột nhắt trắng

3.1.1. Thiết lập mô hình chuột mang u

- Chọn 50 con chuột nhắt trắng, thể trọng trung bình 18-22g, đực cái mỗi loại một nửa,

- Với kỹ thuật vô khuẩn, bằng phương pháp di thực trong ung thư, chọc hút dịch màng bụng của chuột ung thư gan (H₂₂) sinh trưởng 7 ngày, dùng nước muôi sinh lý pha thành huyền dịch tế bào đạt nồng độ 3x10⁷ tế bào/ml.

- Dùng huyền dịch tế bào này tiêm vào dưới da vùng hõm nách của chuột thí nghiệm, mỗi con tiêm 0,2ml.

- Ngày tiếp theo cân thể trọng chuột, giết chết chuột và mổ tách khối u, cân trọng lượng khối u.

- Tính toán tỷ lệ ức chế khối u tăng trưởng theo công thức: Tỷ lệ ức chế = (1 – trọng lượng khối u trung bình ở nhóm chuột thí nghiệm/trọng lượng khối u trung bình ở nhóm chuột đối chứng) x 100

3.1.2. Phân nhóm và cho thuốc

- Chuột sau khi được cấy tế bào ung thư dòng H₂₂ ở trên, sau 24 giờ được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm: nhóm mô hình, nhóm dùng Cyclophosphamide, nhóm dùng Kacimex (liều cao, liều trung bình và liều thấp).

- Nhóm mô hình: bơm vào dạ dày 0,4ml nước cất hâm nóng,mỗi ngày 1 lần, liên tục trong 10 ngày.

- Nhóm dùng Cyclophosphamide tiêm phúc mạc 0,2ml để có liều 20mg/kg thể trọng chuột, ngày 1 lần liên tục trong 10 ngày.

- Nhóm dùng Kacimex (liều cao, liều trung bình và liều thấp): bơm dạ dày 0,4ml thuốc Kacimex đã pha chế thành dung dịch phân biệt đạt 40, 30, 15mg/ml theo nhóm liều khác nhau liên tục trong 10 ngày.

3.1.3. Xác định tỷ lệ ức chế khối u của Kacimex trên động vật thí nghiệm

            Sau lần cho thuốc cuối cùng 24 giờ, giết chết chuột và mổ tách khối u, cân trọng lượng khối u.

Tính toán tỷ lệ ức chế khối u theo công thức: Tỷ lệ ức chế = (Trọng lượng khối u trung bình ở nhóm chuột mô hình - Trọng lượng khối u trung bình ở nhóm chuột dùng thuốc)/ Trọng lượng khối u trung bình ở nhóm chuột mô hình x 100

3.2. Ảnh hưởng của thuốc Kacimex đến kéo dài thời gian sống sót của chuột nhắt trắng ung thư gan dòng H₂₂

3.2.1. Thiết lập mô hình chuột nhắt tráng ung thư gan dòng H₂₂ tràn dịch phúc mạc

- Chọn 50 con chuột nhắt trắng, thể trọng trung bình 18-22g, đực cái mỗi loại một nửa,

- Với kỹ thuật vô khuẩn, bằng phương pháp di thực trong ung thư, chọc hút dịch màng bụng của chuột ung thư gan (H₂₂) sinh trưởng 7 ngày, dùng nước muối sinh lý pha thành huyền dịch tế bào đạt nồng độ 2x10⁷ tế bào/ml.

- Dùng huyền dịch tế bào này tiêm vào khoang phúc mạc của chuột thí nghiệm, mỗi con tiêm 0,2ml.

3.2.2. Phân nhóm và cho thuốc

- Chuột sau khi được cấy tế bào ung thư dòng H₂₂ ở trên được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm: nhóm mô hình, nhóm dùng Cyclophosphamide, nhóm dùng Kacimex (liều cao, liều trung bình và liều thấp).

- Nhóm mô hình: bơm vào dạ dày 0,4ml nước cất ,mỗi ngày 1 lần, liên tục trong 10 ngày.

- Nhóm dùng Cyclophosphamide tiêm dưới da 0,2ml để có liều 20mg/kg thể trọng chuột, ngày 1 lần liên tục trong 10 ngày.

- Nhóm dùng Kacimex (liều cao, liều trung bình và liều thấp): bơm dạ dày 0,4ml thuốc Kacimex đã pha chế thành dung dịch phân biệt đạt 40, 30, 15mg/ml theo nhóm liều khác nhau liên tục trong 10 ngày.

3.2.3. Quan sát ảnh hưởng của Kacimex đến thời gian sống sót của chuột thí nghiệm

Sau khi liên tục cho thuốc 10 ngày, ngừng dùng thuốc và theo dõi thời gian sống sót của chuột thí nghiệm. Tính toán tỷ lệ kéo dài thời gian sống sót của chuột thí nghiệm theo công thức sau:

Tỷ lệ kéo dài thời gian sống (%) = (Số ngày sống sót trung bình của các nhóm cho thuốc/số ngày sống sót trung bình của nhóm đối chứng – 1) x 100%

KẾT QUẢ

1. Kết quả thí nghiệm in vivo

Bảng 1. Tác dụng ức chế khả năng tăng sinh tế bào của thuốc Kacimex là rất rõ và hơn nhóm đối chiếu.

Bảng 2. Tác dụng ức chế khả năng tăng sinh tế bào của thuốc Kacimex đối với người ung thư gan:  Kacimex tác dụng đối với tế bào HEPG2 ở người ung thư gan trong vòng 48h , ức chế sự phát triển đối với tế bào HFPG2 không được rõ rệt. 

Bảng 3. Tác dụng ức chế khả năng tăng sinh tế bào của tế bào SGC - 7901 đối với người ung thư dạ dày.

   Kacimex tác dụng đối với tế bào SGC – 7901 ở người ung thư dạ dày trong vòng 48h , có khả năng ức chế tế bào khá rõ rệt , đồng thời thể hiện quan hệ phụ thuộc vào liều lượng.

2. Kết quả thí nghiệm trong cơ thể

Bảng 1. Ảnh hưởng của Kacimex trong thời kỳ sống đối với chuột ung thư bụng trướng nước

Qua các nồng độ của nhóm Kacimex đối với thời kỳ kéo dài sự sống của chuột khối u, có tác dụng không rõ rệt.

Bảng 2. Ảnh hưởng của Kacimex đối với tỉ lệ ức chế khối u ở chuột

Các nhóm Kacimex thông qua chữa trị chuột khối u, cân nặng đều tăng lên với mức độ  khác nhau, nhưng nhóm điều trị Kacimex với liều lượng thấp làm cho lượng tăng cân nặng cao hơn nhóm Cyclophosphamide rõ rệt.

KẾT LUẬN:

            + Từ kết quả nghiên cứu trên thực nghiệm, cho thấy :

             1.Kacimex của Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo Việt Nam sản xuất từ một số Thảo dược có tác dụng phòng và điều trị ung thư ở mức tế bào.

        2.So với nhóm chứng Kacimex có tác dụng ức chế khả năng tăng sinh tế bào trên mô hình thực nghiệm. Như vậy Kacimex có tác dụng tốt trong điều trị ung thư gan, ung thư dạ dày và khả năng kéo dài tuổi thọ cho nguời mắc các bệnh hiểm nghèo nói trên.

          3. Điểm khác biệt của Kacimex so với nhóm chứng là ngoài tác dụng điều trị khối u không có sự khác biệt thuốc Kacimex không độc, không gây tác dụng phụ không có lợi, thuốc còn giúp cơ thể phục hồi sức khoẻ.

TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ GAN Ở CHUỘT BẠCH VÀ ẢNH HƯỞNG CHỨC NĂNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI CHUỘT CỦA THUỐC KACIMEX

TẠI VIỆN DƯỢC LÝ LÂM SÀNG ĐẠI Y NANING –QUẢNG TÂY TRUNG QUỐC

1  Vật liệu

1.1.Thuốc dùng trong thí nghiệm

Thuốc Kacimex: Do Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo sản xuất

Cyclophosphamide;  Hằng Thụy Giang Tô   số lô:06041521

5-Fluorouracil

1. 2 Động vật và khối u         

Cấp SPF ,thể trọng 18～ 22g , chuột đực chuột cái số lượng mỗi loại một nửa, do Trung tâm thí nghiệm động vật Đại học y khoa Quảng Tây cung cấp, giấy phép hợp lệ số: SCXK  2003-0003. Ung thư gan chuột bạch khối tế bào H22, khối tế bào 7404, khối tế  bào SGC-7901, khối tế bào HEPG2 đều do phòng thí nghiệm dược lý Đại học y khoa Quảng Tây lưu giữ.

1. 3 Thuốc thử và máy móc

MTI：sản phẩm công ty Sigma Mỹ ; RP MI - 1640  (Công ty Hyclone)

Huyết thanh bò mới sinh (Công ty Tứ Quý Thanh Hàng Châu)

Máy đánh dấu enzyme hoàn toàn tự động (Thermo Electron Corporation) máy dịch chuyển vi lượng (Biohit);  kính hiển vi đảo ngược đa công năng (XD-101)

Thùng nuôi CO2 ( Thermo Forma Direct Heat CO2 Incubato ) 

Bàn làm việc siêu sạch (SW-CJ -1B)

Tủ lạnh nhiệt độ siêu thấp (MDF-382E)

2  Xác định tác dụng ức chế sinh nở tế bào của thuốc bằng phương pháp so sánh sắc phổ MTT

Gọi khối tế bào 7404 là đối số trong thời kỳ sinh trưởng, SGC-7901 , tế bào khối u HEPG2 với 3 loại người phân biệt dùng Pancreatin để xử lý tiêu hóa ,dùng dung dịch nuôi RPMI -1640 gồm 10%nhiệt để diệt khuẩn huyết thanh thai bò, chế thành mật độ tế bào là 1X10⁷ tế bào/ml đơn tế bào, tiêm vào tấm ván nuôi 96 lỗ ,mỗi lỗ là 1901,cho vào 5% CO2,độ ẩm tương đối là 95%,trong thùng nuôi CO2 thường nuôi 8h với nhiệt độ là 37℃ ,giả thiết đó là nhóm đối chiếu(chỉ thêm 5-Fu, không thêm thuốc ).  Nuôi trong vòng 48 h, cho thêm vào 10  1MTT( 5g/L) ,với điều kiện giống nhau nuôi liên tục sau 4h ,nhanh chóng lật tấm ván nuôi và bỏ đi dung dịch nuôi ở trong lỗ , mỗi lỗ thêm  vào 150  1DMSO, với nhiệt độ trong phòng thí nghiệm đặt lên trên máy dao động vi lượng tránh ánh sáng và giao động trong vòng 10 min, để cho kết tinh tan hoàn toàn, dùng enzyme tự động hoàn toàn kết hợp với máy đo kiểm nghiệm miễn dịch với bước sóng 570 nm , với điều kiện tham khảo bước sóng là 630 nm , đo giá trị OD(độ hút quang)của các lỗ và từ đó tính tỉ lệ ức chế.

［tỉ lệ ức chế(%) =(1－giá trị OD nhóm thí nghiệm /giá trị OD nhóm đối chiếu )X100%］hãy tính IC50.  kết quả xem bảng 1

3. Thí nghiệm trong cơ thể

3. 1 Thuốc Kacemex Việt Nam sản xuất ảnh hưởng đối với tác dụng khối u thực thể(H22) ung thư gan ở chuột bạch      

3. 1. 1 Xây dựng mô hình khối u chuột

  Lấy chuột bạch sạch sẽ khỏe mạnh với thể trọng là 20± 2g, 50 con ,đực và cái mỗi bên một nửa , dựa vào phương pháp nghiên cứu cấy ghép khối u, với điều kiện đã qua tiệt trùng lấy nước trong bụng chuột bị ung thư gan (H22) sinh trưởng 7d ra , dùng Natriclorit loãng để cho số tế bào đạt tới 3x10⁷ tế bào/ml , tiêm vào nách chuột bạch 0.2ml/con.

Ngày tiếp theo cân thể trọng ,sau khi giết chết chuột bóc miếng khối u ra , cân khối u.

Tỉ lệ ức chế phát triển khối u được tính theo công thức sau:

Tỉ lệ ức chế khối u(%) = (1 – bình quân trọng lượng khối u nhóm thí nghiệm và bình quân trọng lượng khối u nhóm đối chiếu )

3. 1. 2 P hân nhóm và cho thuốc

   Lấy chuột sau khi đã tiêm tế bào H22 24h  chia làm 5 nhóm, nhóm mô hình , nhóm Cyclophosphamide, nhóm thuốc Việt nam liều cao , nhóm thuốc Việt nam liều trung bình và nhóm thuốc Việt nam liều thấp, (tiêm NS 0.2ml vào nách bên phải của chuột. Nhóm mô hình cho vào dạ dày 0.4 ml nước cất ,mỗi ngày một lần; nhóm Cyclophosphamide cho vào 20 mg/kg , tiêm vào khoang bụng , mỗi ngày một lần ;nhóm thuốc Việt nam với liều lượng cao , trung bình và thấp cho lần lượt là 45, 30, 15 mg/ml, cho vào dạ dày 0.4 ml , mỗi ngày 1 lần , cho thuốc liên tục 10d.

3. 1. 3 Đo tỉ lệ ức chế khối u trong cơ thể của thuốc Việt Nam

  Lần cuối cho thuốc sau 24h giết chết chuột bóc lấy khối u, cân trọng lượng khối u và tính tỉ lệ ức chế khối u.

Tỉ lệ ức chế khối u(%) = (trọng lượng khối u nhóm mô hình- trọng lượng khối u nhóm chữa trị)/ trọng lượng khối u nhóm mô hình x 100%

3. 2  Ảnh hưởng đối với thuốc Việt Nam về kéo dài thời gian sống sót ở chuột bụng trướng nước (H22) ung thư gan

3. 2. 1   Xây dựng mô hình bụng trướng nước(H22) ở chuột

   Lấy chuột con sạch sẽ khỏe mạnh với thể trọng là 20± 2g , 50 con , chuột đực chuột cái số lượng mỗi loại một nửa, dựa vào phương pháp cấy ghép khối u ,với điều kiện đã qua tiệt trùng lấy bụng trướng nước(H22) ung thư gan chuột sinh trưởng 7d ra, dùng Natriclorit loãng để số tế bào đạt tới 2x 10⁷ tế bào/ml ,tiêm vào khoang bụng chuột con, 0.2ml/con .             

3. 2. 2   P hân nhóm và cho thuốc

   Lấy chuột con đã tiêm vào ngày tiếp theo chia làm 5 nhóm, nhóm mô hình, nhóm Cyclophosphamide, nhóm thuốc Việt nam liều cao, trung bình và thấp . Nhóm mô hình cho vào dạ dày 0.4 ml nước cất, mỗi ngày một lần ; nhóm Cyclophosphamide cho vào Cyclophosphamide 20mg/kg, tiêm thuốc vào da, mỗi ngày một lần; nhóm thuốc Việt Nam với liều lượng cao, trung bình và thấp phân biệt cho thuốc Việt nam lần lượt là 45, 30, 15 mg/ml, cho vào dạ dày 0.4 ml, mỗi ngày một lần.

3.2.3  Ảnh hưởng thời gian sống sót của chuột bụng trướng nước(H22) ung thư gan         

  Cho thuốc liên tục 10 ngày, sau khi dừng thuốc quan sát xem thời gian sống sót của chuột. Tỉ lệ kéo dài tuổi thọ được tính theo công thức sau:

Tỉ lệ kéo dài tuổi thọ (%) = (bình quân số ngày sống sót nhóm cho thuốc/ bình quân số ngày sống sót nhóm đối chiếu – 1) x100%.       

4   Kết quả

4. 1 Kết quả thí nghiệm ngoài cơ thể

4. 1.1 Tác dụng ức chế của thuốc Kacimex đối với sự phát triển tế bào 7404 ung thư gan ở người : Thuốc Kacimex tác dụng đối với tế bào 7404 ung thư gan ở người trong vòng 48h, nó có khả năng ức chế sinh nở rõ rệt , đồng thời nó cũng có quan hệ phụ thuộc vào liều lượng của thuốc. Kết quả xem bảng 1.

4. 1. 2 Kacimex tác dụng ức chế đối với sự phát triển tế bào HEPG2 ung thư gan ở người, Kacimex tác dụng đối với tế bào HEPG2 ung thư gan ở người trong vòng 48h, đối với ức chế sinh nở tế bào HEPG2 không rõ rệt. Kết quả xem bảng 2

4. 1. 3 Kacimex tác dụng ức chế đối với sự phát triển tế bào khối tế bào SGD-7901 ung thư dạ dày ở người

  Kacimex tác dụng đối với tế bào SGC -7901 ung thư dạ dày ở người trong vòng 48h, có khả năng ức chế sự phát triển của nó khá rõ rệt,  còn biểu hiện mối quan hệ phụ thuộc vào liều lượng của thuốc.  Kết quả xem bảng 3. 

4. 2 Kết quả thí nghiệm trong cơ thể

4.2.1 Ảnh hưởng của Kacimex đối với thời kỳ sống sót ở chuột bị ung thư bụng trướng nước Kacimex các nhóm nồng độ đối với thời kỳ sống sót ở chuột bụng trướng nước tác dụng kéo dài không rõ rệt.

4. 2.2 ̉Ảnh hưởng của Kacimex đối với tỉ lệ ức chế khối u ở chuột có khối u

  Kacimex chữa trị các nhóm về thể trọng ở chuột có khối u đều có mức độ tăng lên không giống nhau, nhưng Kacimex ở nhóm chữa trị với liều lượng thấp, thể trọng của chuột tăng lên với một lượng cao rõ rệt, còn cao hơn cả nhóm Cyclophosphamide.  Kacimex chữa trị các nhóm chuột có khối u có tác dụng ức chế  nhất định, nhưng tỉ lệ ức chế khối u không rõ rệt bằng Cyclophosphamide (Kết quả xem bảng 5).