Ảnh hưởng của Cedemex đối với hàm lượng cAMP và cGMP tại các vùng não khác nhau trên chuột cống cai nghiện morphine

TẠP CHÍ DƯỢC LIỆU TRUNG QUỐC

Cuốn 33 Số 12 - tháng 6  năm 2008

Tạ Hải Nguyên¹, Lại Thuật¹, Hoàng Kiến Xuân¹, Tưởng Vĩ Chiết¹, Quách Tùng Siêu¹, Hoàng Nhân Bân¹, Nguyễn Phú Kiều², Phạm Kim Mãn²,  Trần Đình Bình²

(1. Đại học y khoa Quảng Tây phòng nghiên cứu giảng dạy dược lý học, Naning Quảng Tây 530021;

2. Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo Việt Nam, Hà Nội – Việt Nam)

TÓM TẮT

Mục đích:

          Quan sát  ảnh huởng  của Cedemex  đến  hàm lượng cAMP và cGMP  tại các vùng não khác nhau trên chuột cống cai nghiện morphine duới tác dụng thúc nghiện của Naloxone .

Phương pháp:

- Thành lập  8 nhóm thực nghiệm, mỗi nhóm gồm 10 con chuột cống.

          Nhóm 1: Nhóm đối chứng

          Nhóm 2:  Nhóm đối chứng Cedemex thường

          Nhóm 3: Nhóm ngừng dùng morphine

          Nhóm 4: Nhóm tiếp tục dùng morphine

          Nhóm 5: Nhóm sử dụng Cedemex liều cao, 8mg/kg/ngày

          Nhóm 6: Nhóm sử dụng Cedemex liều trung bình, 4mg/kg/ngày

          Nhóm 7: Nhóm sử dụng Cedemex liều thấp, 2mg/kg/ngày

          Nhóm 8: Nhóm đối chiếu thuốc dương tính, uống thuốc Ích An

- Xây dựng mô hình chuột nghiện morphine bằng phương pháp liều tăng dần, tiêm dưới da morphine trong 7 ngày

-Dùng phương pháp thử miễn dịch phóng xạ đo hàm lượng cAMP và cGMP ở các vùng VTA, vỏ não và hải mã.

Kết quả:

- Cedemex có tác dụng bình ổn các triệu chứng của hội chứng cai trên chuột cống nghiện morphine (P<0,05).

- So với nhóm đối chứng thì nhóm tiếp tục dùng morphine có khả năng làm tăng hàm lượng cAMP, giảm hàm lượng cGMP  ở vùng VTA, vỏ não, hải mã trên chuột cống nghiện morphine (P<0,05).

- Sử dụng Cedemex ngắn hạn làm giảm hàm lượng cAMP, tăng hàm lượng cGMP rõ rệt ở các vùng VTA, vỏ não, hải mã trên chuột cống cai nghiện morphine.

Kết luận: Cedemex có tác dụng bình ổn các triệu chứng của hội chứng cai trên chụôt cống nghiện morphine, cơ chế tác dụng do Cedemex tham gia vào điều tiết quá trình sản xuất hàm lượng cAMP và cGMP  trong mô não.

[Từ khóa] Cedemex, nghiện morphine, triệu chứng của hội chứng cai, cAMP và cGMP

[Số hiệu phân loại tài liệu Trung Quốc ] R285.5; [Mã số tài liệu] A;

[Số hiệu bài viêt tạp chí] 1001-5302(2008)12-1439-05

          Cedemex là thuốc hỗ trợ cắt cơn nghiện ma túy, do Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo Việt Nam nghiên cứu và sản xuất , thuốc có dạng viên nang  được bào chế từ nhiều loại thảo dược như có Hoàng Liên, Đỗ trọng … hơn 10 loại thảo dược. Tại Việt Nam thuốc đã được ứng dụng hỗ trợ cắt cơn trên hàng nghìn người nghiện ma túy nhóm Opiates và có tác dụng cai nghiện tốt. Nghiên cứu thực nghiệm trên động vật của tác giả trong giai đoạn trước cho thấy, Cedemex có tác dụng điều trị các triệu chứng của hội chứng cai trên chuột cống cai nghiện morphine [1], hiện vẫn chưa rõ tác dụng điều trị này có liên quan đến sự thay đổi hàm lượng cAMP và cGMP hay không. Chúng tôi thông qua phương pháp thử miễn dịch phóng xạ tiến hành đo hàm lượng cAMP, cGMP ở các vùng não khác nhau trên chuột cống nghiện morphine, để quan sát ảnh hưởng của Cedemex đến hàm lượng cAMP, cGMP trong não chuột cống cai nghiện morphine, từ đó tiến hành nghiên cứu sâu hơn khả năng bình ổn các triệu chứng của hội chứng cai.

1. Nguyên vật liệu:

1.1 Động vật: Chuột cống SD , chuột cái, cân nặng 180 ~ 220g, theo tiêu chuẩn động vật thí nghiệm số SYKG Quảng Tây 2003-0005, do Trung tâm thí nghiệm động vật Đại học Y Khoa Quảng Tây cung cấp.

1.2 Thuốc và thuốc thử:

- Cedemex, dạng viên nang, do Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo Việt Nam sản xuất, mỗi viên nang gồm 500mg cao toàn phần (gồm: Hoàng liên, đỗ trọng, sinh địa…).

 Trước khi sử dụng lấy 80 viên nang hòa tan trong 30ml nước ấm, sau đó thêm 10ml nước cất được dung dịch pha chế hàm lượng 1g/ml, dịch này dùng để bơm vào dạ dày (ig);

-  Dung dịch tiêm morphine clohydrat, xưởng thuốc số 1 Thẩm Dương, số lô 20040604;

-Thuốc đối chiếu dương tính thuốc uống Ích An đã được phép sản xuất và tiêu thụ của Nhà nước Trung Quốc, công ty dược TNHH Thiên Đại  (Châu Hải), số giấy phép lưu hành Z20020032, số hiệu phê chuẩn G50101.

- Naloxone: công ty TNHH sản xuất thuốc Ích Kiều (Hồ Nam), số lô 20040319.

- Bộ thuốc thử đo miễn dịch phóng xạ cAMP và cGMP, mua tại phòng thí nghiệm chất đồng vị Đại học Trung y Thượng Hải.

1.3 Máy móc phục vụ thí nghiệm: máy đếm tia gamma miễn dịch phóng xạ tự động hoàn toàn GC – 911, của Tổng công ty khoa học kỹ thuật thực nghiệm Đại học Khoa học kỹ thuật Trung Quốc.

2. Phương pháp

2.1 Xây dựng mô hình chuột cống nghiện morphine trong 7 ngày[2] :

Từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 7 tiến hành như sau:

-     Nhóm đối chứng và nhóm Cedemex thường mỗi ngày 2 lần tiêm dưới da nước muối sinh lý (NS);

-     Các nhóm khác áp dụng phương pháp tăng dần liều theo tài liệu, tiến hành tiêm morphine dưới da cho chuột cống, liều lượng mỗi ngày lần lượt là 20, 40, 60, 80, 100, 100, 100mg/kg, mỗi ngày tiêm 2 lần dưới da ở lưng (sc).

2.2 Chia nhóm và cấp thuốc:

Các nhóm tiến hành xử lý khác nhau trong 5 ngày, thực nghiệm từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12 tiến hành như sau:

- Nhóm đối chứng: tiếp tục tiêm dưới da vùng lưng NaCl 0,9% liên tục 5 ngày;

- Nhóm Cedemex thường: mỗi ngày 2 lần bơm Cedemex vào dạ dày theo liều lượng 8g/kg(2 ngày), 4g/kg(2 ngày), 2g/kg(1 ngày);

- Các nhóm khác sau lần cuối cho dùng morphine, phân ngẫu nhiên thành 6 nhóm:

+ Nhóm  ngừng dùng morphine: ngừng dùng morphine đồng thời mỗi ngày 2 lần tiêm  dưới da vùng lưng  NaCl 0,9%, liên tục trong 5 ngày;

+ Nhóm tiếp tục dùng morphine: tiêm morphine 100mg/kg/ngày, liên tục trong 5 ngày;

+ Nhóm sử dụng Cedemex  liều cao 8g/kg , bơm vào dạ dày liên tục trong 5 ngày;

+ Nhóm sử dụng Cedemex  liều trung bình 4g/kg , bơm vào dạ dày liên tục trong 5 ngày;

+ Nhóm sử dụng Cedemex  liều thấp 2g/kg , bơm vào dạ dày liên tục trong 5 ngày;

+ Nhóm uống dung dịch Ích An: mỗi ngày 2 lần bơm vào dạ dày, mỗi lần 0.001 , 0.0005 , 0.00025 mL/g, tổng cộng sử dụng trong  5 ngày.

2.3 Quan sát triệu chứng của hội chứng cai và lấy mẫu :

Thí nghiệm ngày thứ 13, 8 nhóm chuột cống ở trên đều được tiêm Naloxone vào khoang bụng (4mg/kg) để thúc đẩy hội chứng cai. Dùng phương pháp đánh giá bằng cho điểm Machi-chi-sư [3] quan sát các nhóm chuột cống trong vòng 1 giờ để xuất hiện những tiêu chí khách quan như: chảy nước dãi, nghiến răng, ỉa chảy… và tình trạng giảm thể trọng (15 phút cho điểm 1 lần). Ghi lại điểm trung bình các triệu chứng của hội chứng cai trong 1 giờ, sau đó giết toàn bộ chuột cống, lấy não, tách các vùng não khác nhau dưới điều kiện nhiệt độ thấp, sau đó cho vào trong ống nghiệm Ependoff 1,5ml, bảo quản trong thùng nitơ lỏng -80^oC, đợi đo, xem bảng 1.

Bảng 1: Phương pháp đánh giá bằng cho điểm theo Machi-Chi-Sư

2.4 Đo hàm lượng cAMP và cGMP bằng phương pháp thử miễn dịch phóng xạ:

Lấy khoảng 50mg tổ chức não đã tách được bảo quản trong thùng nitơ lỏng -80^oC, sau khi cân cho vào ống nghiệm 10ml, trong đó có chứa 2 ml dung dịch đệm axetat 50mmol/l (pH4,70) đã làm lạnh. Đem tổ chức não nghiền mịn thành dung dịch treo rồi cho vào một ống nghiệm khác 10ml, dùng 2ml cồn êthylic 75% rửa máy nghiền 1 lần, rồi dùng cồn đó đổ vào dung dịch treo, trộn đều để yên 5 phút, ly tâm 15phút ở nhiệt độ 4^oC với tốc độ 3500 vòng/phút, lấy phần dung dịch trong ở trên đổ vào một ống nghiệm 10ml khác, rồi lại dùng 2ml cồn êthylic 75% rửa phần kết tủa, trộn đều, ly tâm tiếp 15 phút ở nhiệt độ 4^oC với tốc độ 3500 vòng/phút. Gộp với dung dịch trong trên sấy khô trong tủ sấy 60^oC đợi khô xong thì đem phần cặn bảo quản trong tủ lạnh 4^oC để chờ đo. Sau đó theo hướng dẫn sử dụng của hộp kit tiến hành đo miễn dịch phóng xạ đồng thời tính ra nồng độ cAMP và cGMP, đơn vị là pmol/g.

2.5 Xử lý số liệu:

Dùng phần mềm thống kê số liệu SPSS 10.0, số liệu thực nghiệm biểu thị bằng ±s, so sánh trị số trung bình của các nhóm bằng phương pháp phân tích sai số ANOVA (đơn nhân tố), dùng S-N-K để so sánh kép, nếu P<0,05 nghĩa là khác biệt có ý nghĩa thống kê.

3. Kết quả:

3.1 Cedemex điều trị ngắn hạn có tác dụng bình ổn các triệu chứng của hội chứng cai trên chuột cống nghiện morphine với sự thúc đẩy của Naloxone

          Sau khi thúc đẩy chuột nghiện morphine bằng Naloxone sẽ xuất hiện các triệu chứng của hội chứng cai và sự giảm thể trọng (P<0,05), chứng minh rằng đã thiết lập thành công mô hình chuột cống nghiện morphine. So sánh với nhóm ngừng dùng morphine thì 3 nhóm sử dụng Cedemex liều 8, 4, 2g/kg đều có tác dụng ức chế rõ rệt các triệu chứng của hội chứng cai (thông qua điểm đánh giá) trên chuột cống nghiện morphine với sự thúc đẩy bằng Naloxone, nhóm sử dụng Cedemex liều 8, 4g/kg còn có khả năng chống giảm thể trọng rõ rệt trong một giờ (P<0,05). Kết quả xem bảng 2

Bảng 2 : Điểm đánh giá triệu chứng của hội chứng cai và tỷ lệ giảm thể trọng của các nhóm chuột cống (±s, n=10)

Chú thích: So sánh với nhóm chứng ⁽¹⁾ P<0,05; So sánh với nhóm ngừng dùng morphine⁽²⁾              P <0,05 ( bảng 3 - 5 giống nhau)

3.2 Ảnh hưởng của Cedemex đến hàm lượng cAMP ở các vùng não khác nhau trên chuột cống cai nghiện morphine

So sánh với nhóm đối chứng thì nhóm Cedemex thường hầu như không có ảnh hưởng đến hàm lượng cAMP tại các vùng VTA, vỏ não, hải mã, sự khác biệt  không có ý nghĩa thống kê. Còn nhóm ngừng dùng morphine, tiếp tục dùng morphine thì hàm lượng cAMP ở vùng VTA, vỏ não, hải mã tăng lên rõ rệt so với nhóm đối chứng (P<0,05); Nhóm tiếp tục sử dụng morphine thì hàm lượng cAMP tại 3 vùng não có biên độ tăng cao nhất. So sánh với nhóm ngừng dùng  morphine thì 3 nhóm sử dụng Cedemex liều 8, 4, 2 g/kg  đều có khả năng làm giảm hàm lượng cAMP trong nhu mô ở 3 vùng VTA, vỏ não, hải mã  (P<0,05). Kết quả xem bảng.

Bảng 3: Biến đổi hàm lượng cAMP tại các vùng não liên quan trên chuột cống nghiện và cai nghiện morphine (±s,n=10)

3.3 Ảnh hưởng của Cedemex đối với hàm lượng cGMP ở các vùng não khác nhau trên chuột cống cai nghiện morphine

          Nhóm đối chiếu Cedemex thường hầu như không có ảnh hưởng tới hàm lượng cGMP, so sánh với nhóm đối chứng không có ý nghĩa thống kê. Còn nhóm ngừng dùng morphine, nhóm tiếp tục dùng morphine thì hàm lượng cGMP ở các vùng VTA, vỏ não, hải mã giảm rõ rệt so với nhóm đối chứng (P<0,05); Trong đó nhóm tiếp tục sử dụng morphine thì hàm lượng cGMP tại 3 vùng não có biên độ giảm xuống là lớn nhất, so sánh với nhóm ngừng dùng morphine thì 3 nhóm sử dụng Cedemex liều 8, 4, 2 g/kg đều có khả năng làm tăng rõ rệt hàm lượng cGMP ở 3 vùng VTA, vỏ não, hải mã (P<0,05) đồng thời thể hiện tính tương quan liều lượng rõ rệt. Kết quả xem bảng 4.

Bảng 4: Biến đổi hàm lượng cGMP tại các vùng não liên quan trên chuột cống nghiện và cai nghiện morphine (±s,n=10)

3.4 Sự biến đổi về tỷ lệ cAMP/cGMP ở các vùng não liên quan trên chuột cống nghiện và cai nghiện morphine (pmol/g)

          Nhóm chuột cống ngừng dùng morphine, tiếp tục sử dụng morphine thì tỷ lệ cAMP/cGMP ở 3 vùng VTA, vỏ não, hải mã tăng cao rõ rệt so với nhóm đối chứng (P<0,05); 3 nhóm Cedemex liều cao, trung bình, thấp đều có thể hồi phục bình thường tỷ lệ cAMP/cGMP ở 3 vùng VTA, vỏ não, hải mã (P<0,05) đồng thời thể hiện tính tương quan về liều lượng rõ rệt. Kết quả xem bảng 5.

Bảng 5: Biến đổi tỷ lệ cAMP/cGMP tại các vùng não liên quan trên chuột cống nghiện và cai nghiện morphine (±s, n=10)

4. Thảo luận:

          Hiện nay đa số tác giả cho rằng, tính thích ứng tăng lên của hệ thống cAMP có thể đã tham gia vào sự sản sinh và phát triển tính lệ thuộc và dung nạp của nhóm Opiat, đồng thời cuối cùng cơ thể đạt tới sự cân bằng trạng thái bệnh lý mới [4-9]. Thí nghiệm này sử dụng phương pháp liều tăng dần để thiết lập mô hình chuột nghiện morphine trong 7 ngày đồng thời sử dụng 3 liều lượng Cedemex để quan sát tác dụng điều trị của Cedemex đối với triệu chứng của hội chứng cai trên chuột cống nghiện morphine. Kết quả chỉ rõ, sử dụng Cedemex với liều lượng 8, 4, 2g/kg đều có tác dụng bình ổn rõ rệt các triệu chứng của hội chứng cai trên chuột cống nghiện morphine. Đặc biệt là liều Cedemex 8g/kg và 4g/kg cho hiệu quả tốt hơn. Cedemex liều 8g/kg và 4g/kg còn có tác dụng chống giảm thể trọng của chuột trong 1 giờ do phản ứng đối kháng cắt cơn. Đồng thời phát hiện hàm lượng cAMP cao trong mô hình chuột đã nghiện, thấp trong nhóm bình thường, giống với tình hình biến đổi về điểm đánh giá các triệu chứng của hội chứng cai. Do đó  cho rằng hàm lượng cAMP cao hơn bình thường, có thể gián tiếp chứng minh thiết lập mô hình thành công.

          Nhóm ngừng dùng morphine và tiếp tục dùng morphine thì hàm lượng cAMP tăng cao, cGMP hạ thấp trong nhu mô các vùng vỏ não, hải mã, đồng thời nhóm tiếp tục dùng morphine biến đổi rõ rệt nhất, biểu hiện sự tồn tại mức tăng lên của cAMP và mức giảm xuống của cGMP trong mô não trên chuột nghiện và cai nghiện morphine, nhất trí với các tài liệu đã công bố[4-9]. Những biến đổi này là những biến đổi mang tính thích ứng của thần kinh trung ương sau sử dụng lặp đi lặp lại thuốc gây nghiện. Việc tăng lên của hệ thống cAMP có thể do sự bù đắp về tác dụng trường diễn và phản hồi thông tin đối với việc morphine khống chế hệ thống cAMP dẫn đến sự thể hiện ở gien, là phần cơ sở sinh hóa cấu tạo lên hiện tượng lệ thuộc và dung nạp morphine và các dẫn chất cùng loại; còn việc giảm mức cGMP trong não chuột cống nghiện và cai nghiện morphine đã chứng tỏ sử dụng morphine lâu dài  ảnh hưởng đến cGMP trong trung khu thần kinh, chủ yếu là tác dụng ức chế, cơ chế của vấn đề này còn chờ nghiên cứu sâu hơn. Có người quan sát thấy mức cGMP tăng cao ở trong não hoặc dịch não tủy có thể làm tăng nặng các triệu chứng của hội chứng cai; Sử dụng men ức chế  guanylate cyclase (GC) có thể làm giảm từ từ các triệu chứng của hội chứng cai trên chuột cống nghiện morphine [10-11]. Điều này có thể liên quan đến các yếu tố như: phương pháp thiết lập mô hình động vật nghiện, chủng loại động vật, phương thức dùng thuốc, làm tiêu bản, bộ phận kiểm tra và phương pháp khác nhau... nguyên nhân của nó còn cần tham khảo sâu hơn.

          Kết quả nghiên cứu này cho thấy, Cedemex điều trị ngắn hạn có thể làm giảm rõ rệt hàm lượng cAMP, tăng rõ rệt hàm lượng cGMP ở các vùng não khác nhau trên chuột cống cai nghiện morphine và tỷ lệ cAMP/cGMP khôi phục bình thường, trong đó nhóm sử dụng Cedemex liều 8g/kg và 4g/kg là biến đổi rõ rệt nhất. Cedemex có khả năng thông qua một vài cơ chế ức chế men adenylate cyclase (AC) từ đó làm giảm hàm lượng cAMP đồng thời thông qua cơ chế dẫn truyền tín hiệu khác làm tăng hàm lượng cGMP trong mô tế bào não.

          Kết quả thực nghiệm giải thích Cedemex ức chế phản ứng cai nghiện thông qua việc điều tiết hàm lượng cAMP, cGMP trong não chuột cống cai nghiện morphine. Do đó, khả năng điều tiết hàm lượng cAMP và cGMP của Cedemeex có thể là một cơ chế phân tử quan trọng trong việc bình ổn các triệu chứng của hội chứng cai.

  Dịch thuật : Trần Lộc - ĐH dược Hà Nội.

    ThS .BS.Kiều Tố Uyên –Viện Radiner

Tài liệu tham khảo

{1} Tạ Hải Nguyên, Lại Thuật, Hoàng Kiến Xuân- tác dụng can dự và điều trị của Cedemex đối với triệu chứng ngừng thuốc của chuột lệ thuộc morphin. Tạp chí Đại học Y Quảng Tây, 2007,24(2); 231.

{2} Cố San Chí, Lý Sinh Vũ, ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đối với việc xây dựng mô hình chuột lệ thuộc morphin [J]. Tạp chí Đai học Giao thông Tây An; bản y học, 2003, 25 (5): 446;

{3} Machi Yanaghita, Keko Nakamura, Teka Wasu, sự hình thành gây nghiện của thuốc giảm đau tiêm nhiều lần và cơ thể người [J] Báo nghiên cứ lâm sàng trước nghiên cứu thí nghiệm, 1979,5:139.

{4}Nestler E J, Aghajanian G K. Molecular and cellular basic of addiction [J]. Science, 1997, 278(5335):58

{5} Nestler EJ. Histirical renew: Molecular and cellular mechanisms of opiate and cocaine addiction [J]. Trends Pharmacol Sci, 2004, 25(4): 210.

{6} Lý Vĩ Nham, Từ Kiến Quốc, cơ chế phân tử thần kinh nghiện loại thuốc phiện [J] Tạp chí nghiên cứu y học, 2003,16 (2): 135.

{7}Liu J Q, Anand K J S. Protein kinases modulate the cellular adaptations associated with opioid tolerance and dependence [J]. Brain Research Reviews, 2001, 38:1

{8}Taylor D A, Fleming W W. Unifying perspectives of the mechanisms underlying the development of tolerance and physical dependence to opioids [J]. Pharmacol Experimental Therapeutics, 2001, 297:11.

{9} Gelowitz D L, Berger S P. Signal transduction mechanism and behavioral sensitization drtl: an overview of cAMPand HA2 [J]. J Addict Dis, 2001, 20(3):33.

{10} Burton CK, Ho J K, Hoskim B. Evidence for involvement of cyclic GMP phosphodiesterase in morphine tolerance[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1990,252(1):104.

{11} Dương Nham Linh, Lưu Tú Bình, Khâu Học Tài, ảnh hưởng của hệ thống No-cCMP trung khu đối với việc triệu chứng ngừng thuốc morphin [J]Tạp chí y tế tâm lý Trung Quốc, 2000, 14: 110.