Ảnh hưởng CEDEMEX đối với cAMP và cGMP trong cai nghiện ma túy

TÓM TẮT

Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc Cedemex trên hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não của chuột lang cai nghiện Morphine.

Phương pháp: Gây nghiện Morphine cho chuột lang sau 7 ngày cho Morphine liều tăng dần, thiết lập mô hình gây nghiện cho chuột lang, dùng phương pháp miễn dịch phóng xạ để định lượng cAMP và cGMP trong các vùng VTA, võ não và hồi hải mã.

Kết quả: 1) Cedemex có tác dụng kiểm soát các triệu chứng đói thuốc ở chuột lang cai nghiện Morphine; 2) so với nhóm đối chứng, nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, võ não và hồi hải mã tăng cao rất rõ và hàm lượng cGMP giảm rất rõ; 3) dùng Cedemex ngán ngày có thể làm hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, võ não và hồi hải mã giảm rõ và hàm lượng cGMP tăng lên.

Kết luận: Cedemex có tác dụng ức chế triệu chứng đói thuốc đối với chuột lang cai nghiện Morphine, cơ chế tác dụng do Cedemex tham gia vào điều tiết quá trình sản xuất hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não.

THE EFFECT OF CEDEMEX ON cAMP AND cGMP LEVEL OF DIFFERENT BRAIN AREAS IN MORPHINE WITHDRAWAL RATS

Huang Renbin1, Nguyen Phu Kieu2, Tran Dinh Binh3, Luong Viet Cao2

Guangxi Medical University, Nanning, China

 Critical diseases Research and Treatment Institute, Hanoi, Vietnam

Hue Medical College, Vietnam

Objective: To investigate the effect of Cedemex on cAMP and cGMP contents in different brain regions in morphine withdrawal rats precipitated by naloxone.

Methods: A physical   morphine dependent model of rats was established by subcutaneous injection of morphine in gradually increasing dosage within 7 days. cAMP and cGMP contents of VTA、cortex、hippocampus of the rats’ brain were determined by radioimmunoassay. 

Results: (1)The morphine withdrawal symptoms of rats were relieved significantly by ig Cedemex.(2)Compared with the controls, cAMP contents in the region of VTA, cortex and hippocampus of the morphine dependent rats were significantly higher (P<0.05),while cGMP contents in those  regions were significantly lower (P<0.05). (3)cAMP contents in the area of VTA,cortex and hippocampus of the morphine dependent rats were significantly reduced,while cGMP contents were significantly increased by ig Cedemex.

Conclusion: Cedemex may significantly attenuate the morphine withdrawal symptoms in rats. The mechanism of this effect may be related to adjusting the contents of cAMP and cGMP in some brain region.

Cedemex là thuốc hỗ trợ cắt cơn nghiện ma tuý, thuốc có dạng viên nang hiện đang được sử dụng tại các cơ sở cai nghiện của Việt nam.Thành phần chủ yếu của thuốc bao gồm Hoàng liên, Đỗ trọng, Địa hoàng...hơn 10 loại cây cỏ.Ngoài tác dụng cát cơn nghiện tốt, không xuất hiện triệu chứng đói thuốc..đã được khẳng định. Như những nghiên cứu đã báo cáo trước đây của chúng tôi về Cedemex đã khẳng định tác dụng cai nghiện của thuốc, hiện nay chúng tôi muốn tìm hiểu cơ chế cai nghiện của thuốc này có phải liên hệ đến hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não hay không. Để nghiên cứu cơ chế tác dụng của thuốc Cedemex liên quan đến hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não chúng tôi dùng phương pháp miễn dịch phóng xạ để xác định

hàm lượng của chúng ở các trung tâm khác nhau của tổ chức não.

1. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1. Động vật thí nghiệm: Chuột lang giống SD, chuột đực, năng trung bình 160g-200g, theo tiêu chuẩn động vật thí nghiệm số SYKG Quế 2003-0005, do trung tâm nuôi súc vật thí nghiệm Trường Đại học Y khoa Quảng tây, Trung quốc cung cấp.

1.2. Thuốc dùng và thuốc thử:

- Thuốc Cedemex do Viện Nghiên cứu Điều trị các bệnh hiểm nghèo, Hà nội, Việt nam cung cấp. Thuốc có dạng viên nang, 500mg. Mỗi khi thực hiện thí nghiệm, tiến hành pha 80 viên/30ml nước muối sinh lý，sau đó thêm đủ 40ml, như vậy đạt nồng độ 1g/ml. Hỗn dịch này được dùng để cho chuột thí nghiệm uống.

- Morphine chlohydrate do Xí nghiệp Dược phẩm số 1 Thẩm dương, Trung quốc sản xuất, theo mã số 20040604.

- Yian koufuye do Xí nghiệp Dược phẩm Thiên đại, Chu hải, Trung quốc sản xuất, theo mã số Z20020032.

- Naloxone chlohydrate do Công ty Dược phẩm Chích Kiều, Hồ nam, Trung quốc sản xuất theo mã số 20040319

1.3. Mô hình chuột nghiện Morphine sau 7 ngày thực nghiệm: Trừ 2 nhóm chuột bình thường không cho bất kỳ cái gì ngoài nuôi dưỡng thông thường và nhóm chuột đối chứng được tiêm nước muối sinh lý dưới da, 6 nhóm chuột thí nghiệm đều được cho liều lượng thuốc Morphine tiêm dưới da liều tăng dần theo tài liệu tham khảo số 1. Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 7, liều lượng thuốc phân biệt tăng dần như sau: 20，40，60，80，100，100，100mg/kg/ngày，mỗi ngày 2 lần.

1.4  Xử lý thí nghiệm đối với các nhóm chuột khác nhau: Từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12, tiến hành xử lý khác nhau với các nhóm chuột khác nhau:

① Nhóm chuột bình thường： cho uống nước muối sinh lý liên tục 5 ngày.

② Nhóm đối chứng： Mỗi ngày cho uống 2 lần hỗn dịch thuốc Cedemex, theo thứ tự liều lượng thuốc cao 2 ngày, trung bình 2 ngày và liều thấp 1 ngày.

Số chuột còn lại sau lần cho Morphine sau cùng，phân biệt chia thành 6 nhóm:

③ Nhóm ngừng dùng Morphine: cho uống nước muối sinh lý liên tục 5 ngày.

④ Nhóm tiếp tục dùng Morphine: Tiếp tục tiêm Morphine với liều lượng 100mg/kg/ngày/5 ngày.

⑤ Nhóm dùng Cedemex liều cao：8g/kg/ngày/5 ngày.

⑥ Nhóm dùng Cedemex liều trung bình：4g/kg/ngày/5 ngày.

⑦ Nhóm dùng Cedemexliều thấp：2g/kg/ngày/5 ngày.

⑧ Nhóm chứng dương tính： Sử dụng thuốc cai nghiện theo hướng dẫn lâm sàng thực nghiệm. Mỗi ngày tiêm thuốc hoặc cho thuốc 2 lần, liên tục 5 ngày theo thứ tự liều lượng thuốc cao 2 ngày, trung bình 2 ngày và liều thấp 1 ngày.

1.5. Theo dõi triệu chứng đói thuốc và lấy mẫu thử nghiệm:

Vào ngày thí nghiệm thứ 13, tiêm Naloxone vào phúc mạc của tất cả các nhóm chuột với liều (4mg/kg) để kích thích trạng thái đói thuốc, ghi nhận các triệu chứng đói thuốc trong vòng 1 giờ và tính điểm (theo phương pháp của tài liệu tham khảo số 2). Sau đó giết chết chuột cà mở sọ lấy não bộ, cho vào ống Ependoft, bảo quản trong thùng ni tơ lỏng ở -800C.

1.6. Xác định hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não.

Từ mẫu nghiệm trong thùng ni tơ lỏng ở -800C, lấy khoảng 50mg tổ chức não, sau khi cân xong cho vào ống có dung tích 10mL, trong ống chứa 2mL dung dịch đệm acetic có nồng độ 50mmol/L  (pH4.70). Nghiền đều tổ chức não trong ống và chuyển sang ống khác có chứa 2mL cồn Ethylic 75% để rửa mẫu nghiệm, trộn đều và để yên khoảng 5 phút, ly tâm 3500 vòng/phút/ 15 phút ở 40C. Tách phần nước nổi cho vào một ống 10mL khác, phần cặn còn lại cho thêm 2mL cồn Ethylic 75% để rửa và lại để yên khoảng 5 phút, ly tâm 3500 vòng/phút/ 15 phút ở 40C. Trộn cả 2 phần nước nổi 2 lần trên, cho vào một ống và đưa vào tử sấy 600C làm khố, phần cặn khô còn lại bảo quản ở 40C để làm thí nghiệm. Xác định hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ theo hướng dẫn của hãng sản xuất, đơn vị là pmol/g tổ chức não.

1.6. Xử lý số liệu thống kê: Dùng phần mềm SPSS11.0，các kết quả thí nghiệm biểu thị bằng trị trung bình ( ±s), so sánh các nhóm bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và bảng 2x2.

2. KẾT QUẢ

2.1. Tác dụng điều trị của Cedemex với các triệu chứng đói thuốc của chuột nghiện Morphine sau khi tiêm Naloxone.

Sau khi tiêm Naloxone trên các nhóm chuột, các nhóm chuột xuất hiện triệu chứng đói thuốc và giảm thể trọng (P<0.05)，điều này khẳng định sự thành công của mô hình chuột nghiện thực nghiệm. So sánh với nhóm ngừng dùng Morphine, các nhóm dùng liều lượng Cedemex liều cao, liều trung bình và liều thấp có các triệu chứng đói thuốc ở điểm số thấp hơn, chứng minh được sự giảm triệu chứng đói thuốc của Cedemex (P<0.05)，Nhóm chuột dùng Cedemex liều cao và liều trung bình còn ngăn cản tốt sự giảm thể trọng của chuột (P<0.05) (xem bảng 1).

Bảng 1  Bảng điểm triệu chứng đói thuốc và thể trọng của chuột

So với nhóm bình thường，△P<0,05； so với nhóm ngừng Morphine，▲P<0.05

2.2. Ảnh hưởng của Cedemex đối với hàm lượng cAMP ở các vùng khác nhau của tổ chức não.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, so nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cAMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã không có thay đổi. Tuy nhiên so sánh nhóm ngừng dùng Morphine, nhóm tiếp tục dùng Morphine với các nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cAMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã tăng cao hơn (P<0.05)；nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cAMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã tăng cao hơn cả, so với nhóm chuột ngừng dùng Morphine, các nhóm chuột dùng Cedemex với các liều lượng khác nhau để cai nghiện có thì hàm lượng cAMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã đều giảm và sự giảm này liên hệ đến liều lượng Cedemex dùng để điều trị (P<0.05) (xem bảng 2).

Bảng 2. Sự biến đổi hàm lượng cAMP ở các vùng của tổ chức não của chuột nghiện Morphine (pmol/g)

So với nhóm bình thường，△P<0,05； so với nhóm ngừng Morphine，▲P<0.05

2.3. Ảnh hưởng của Cedemex đối với hàm lượng cGMP ở các vùng khác nhau của tổ chức não.

Kết quả thí nghiệm cho thấy, so nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cGMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã không có thay đổi. Tuy nhiên so sánh nhóm ngừng dùng Morphine, nhóm tiếp tục dùng Morphine với các nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cGMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã giảm đi (P<0.05)；nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cGMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã giảm nhiều nhất, so với nhóm chuột ngừng dùng Morphine, các nhóm chuột dùng Cedemex với các liều lượng khác nhau để cai nghiện có thì hàm lượng cGMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã đều tăng cao và sự tăng này liên hệ đến liều lượng Cedemex dùng để điều trị (P<0.05) (xem bảng 3).

Bảng 3. Sự biến đổi hàm lượng cGMP ở các vùng của tổ chức não của chuột nghiện Morphine (pmol/g)

So với nhóm bình thường，△P<0,05； so với nhóm ngừng Morphine，▲P<0.05

2.4. Sự biến đổi tỷ lệcAMP/cGMP ở các vùng của tổ chức não của chuột nghiện Morphine (pmol/g)

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nhóm ngừng dùng Morphine và nhóm tiếp tục dùng Morphine có tỷ lệ hàm lượng cAMP/cGMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã của tổ chức não cao hơn so với nhóm chuột bình thường và nhóm đối chứng (P<0.05). Nhóm chuột cai nghiện Morphine bằng Cedemex với các liều lượng khác nhau có tỷ lệ hàm lượng cAMP/cGMP ở các vùng VTA, võ não và hồi hải mã của tổ chức não hoàn toàn giống với nhóm chuột bình thường và nhóm đối chứng, đồng thời sự hồi phục này liên hệ đến liều lượng Cedemex dùng để điều trị (P<0.05) (xem bảng 4).

Bảng 4. Sự biến đổi tỷ lệcAMP/cGMP ở các vùng của tổ chức não của chuột nghiện Morphine (pmol/g)

So với nhóm bình thường，△P<0,05； so với nhóm ngừng Morphine，▲P<0.05

3. THẢO LUẬN

       cAMP và cGMP là những chất trung gian quan trọng trong tế bào, chúng có tác động đến sự điều tiết nhiều chức năng hoạt động của tế bào. Trong sự chuyển hóa của tế bào, tế bào cơ co rút, vận chuyển điện tử, phân hóa tế bào, sinh trưởng và chết theo chương trình, biểu đạt tính di truyền, điều hòa nội tiết và phản ứng miễn dịch…đều có tác động của chúng. cAMP và cGMP có lẽ thúc đẩy những quá trình khác nhau của tế bào và thường thường có sự tương hỗ đối kháng [2], [3]. Hiện nay, theo nhiều tác giả báo cáo, hệ thống cAMP thường điều tiết tăng cao để tham gia vào quá trình kết hợp thụ thể của nha phiến (ma túy) và phát triển tính nghiện, đồng thời sau đó cơ thê sẽ phát sinh tính phụ thuốc vào chất gây nghiện để duy trì tình trạng cân bằng mới [4-9].

Vì vậy, để nghiên cứu cơ chế tác dụng của Cedemex ở mức độ phân tử, chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây nghiện Morphine cho chuột lang sau 7 ngày cho Morphine liều tăng dần, thiết lập mô hình gây nghiện cho chuột lang, sau đó dùng Cedemex với liều cao, liều trung bình và liều thấp để điều trị cai nghiện. Kết quả cho thấy so sánh với nhóm ngừng dùng Morphine, các nhóm dùng liều lượng Cedemex liều cao, liều trung bình và liều thấp có các triệu chứng đói thuốc ở điểm số thấp hơn, chứng minh được sự giảm triệu chứng đói thuốc của Cedemex (P<0.05)，Nhóm chuột dùng Cedemex liều cao và liều trung bình còn ngăn cản tốt sự giảm thể trọng của chuột (P<0.05).

Đồng thời, chúng tôi dùng phương pháp miễn dịch phóng xạ để định lượng cAMP và cGMP trong các vùng VTA, võ não và hồi hải mã, kết quả cho thấy:

- Hàm lượng cAMP ở chuột nghiện tăng cao, nhưng ở nhóm chuột bình thường lại thấp, hàm lượng này tương quan với điểm số các triệu chứng đói thuốc. Vì vậy, chúng tôi nhận định hàm lượng cAMP cao hơn bình thường có thể là chứng cứ gián tiếp khẳng định sự thành công của mô hình động vật thí nghiệm.

- Nhóm ngừng dùng Morphine và nhóm tiếp tục dùng Morphine đều có hàm lượng cAMP tăng cao, hàm lượng cGMP giảm đi, mặt khác sự biến đổi này rất rõ ơ nhóm tiếp tục dùng Morphine, điều này cho thấy nghiện Morphine và ngừng dùng Morphine làm tăng hàm lượng cAMP và giảm hàm lượng cGMP trong tổ chức não; các triệu chứng đói thuốc liên hệ mật thiết với hàm lượng cAMP và cGMP trong não, kết quả này hoàn toàn giống với các nghiên cứu khác [4-9].

Những biến đổi này là do các trung khu thần kinh đáp ứng do dùng chất gây nghiện nhiều lần thành nghiện. Sự gia tăng hàm lượng cAMP có lẽ là một phản ứng sinh hóa thay thế trong sự hình thành tính dung nạp hay nghiện ma túy. Mặt khác, hàm lượng cGMP giảm đi chứng tỏ ma túy có tác dụng chính là ức chế sản sinh cGMP. Có nghiên cứu cho rằng những người có hàm lượng cao cGMP trong dịch não thất thì có các triệu chứng đói thuốc nặng hơn, sử dụng chất ức chế (GC)  phosphodiesterase có thể làm giảm các triệu chứng đói thuốc của chuột thí nghiệm [10, 11].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: Cedemex có tác dụng kiểm soát các triệu chứng đói thuốc ở chuột lang cai nghiện Morphine; so với nhóm đối chứng, nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, võ não và hồi hải mã tăng cao rất rõ và hàm lượng cGMP giảm rất rõ; dùng Cedemex ngán ngày làm hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, võ não và hồi hải mã giảm rõ và hàm lượng cGMP tăng lên đến mức bình thường.

Như vậy, Cedemex có tác dụng ức chế triệu chứng đói thuốc đối với chuột lang cai nghiện Morphine, cơ chế ở mức độ phân tử do Cedemex tham gia vào điều tiết sản xuất hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Gu Shanzhi, Li Shengbin. Gezhong shiyan yinsu dui jianli dashu mafei yilai moxing de yingxiang [J]. Xian jiaotong daxue xuebao (Yixue bao). 2004, 25(5), 446-448.

2．Francis SH, Turko IV, Corbin JD. Cyclic nucleotide phosphodiesterases: relating structure and function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2001, 65:1-52.

3.Von Gall C, Stehle JH, Weaver DR. Mammalian melatonin receptors: molecular biology and signal transduction. [J]. Cell Tissue Res. 2002, 309(1), 151-162.

4. Nestler EJ, Aghajanian GK. Molecular and cellular basis of addiction. Science. 1997,  278 (5335): 58-63.

5. Nestler EJ. Historical renew. Molecular and cellular mechanisms of opiate and cocaine addiction. Trends in Pharmacological Sciences, 2004, 25(4), 210-218.

6.Li Weiliao, Xu Jianguo. Yapian lei yilai de shenjing fenzi jizhi. Yixue yanjiusheng xuebao. 2003, 16(2): 135-137.

7.Liu Jq, Anand KJS. Protein kinases modulate the cellular adaptations associated with opioid tolerance and dependence.  Brain Research Reviews, 2001, 38:1-19.

8.Taylor DA, Fleming WW. Unifying perspectives of the mechanisms underlying the development of tolerance and physical dependence to opioids.  The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2001, 297:11-18.

9．Gelowitz DL，Berger SP．Signal transducfion mechanisms and behavioral sensitization to stimulant drtl:an overview of cAMP and HA2[J]. J Addict Dis, 2001, 20(3), 33-42.

10 Burton CK, Ho IK,Hoskim B. Evidence for involvement of cyclic GMP phosphodiesterase in morphine tolerance. J Pharmacol Exp Ther. 1990 Jan;252(1), 104-111.