Ngày 23 tháng 8 năm 2019

Viện nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo: Nghiên cứu thuốc hỗ trợ cai nghiện ma túy (Cedemex),thuốc hỗ trợ điều trị khối u từ thảo dược (Kacimex), thuốc hỗ trợ điều trị HIV (Vegakiss)...

Bệnh viện Hi Vọng Công ty Quế Lâm

26/2/2013 15:35:49

Ảnh hưởng của Cedemex đến hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não chuột lang cai nghiện Morphine

                                                                   Dr. Nguyễn Phú Kiều*, Lương Việt Cao*

                                                                  Prof.Dr.Huang Ren Bin** ,Dr .Xie Hai yuan**

                                                              * Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo, Việt nam

                                                             * * Trường đại học Y khoa Quảng Tây, Nam ninh, Trung quốc

 

TÓM TẮT

Mục đích: Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc Cedemex trên hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não của chuột lang cai nghiện Morphine.

Phương pháp: Gây nghiện Morphine cho chuột lang sau 7 ngày cho Morphine liều tăng dần, thiết lập mô hình gây nghiện cho chuột lang, dùng phương pháp miễn dịch phóng xạ để định lượng cAMP và cGMP trong các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã.

Kết quả: 1) Cedemex có tác dụng kiểm soát các triệu trứng đói thuốc ở chuột lang cai nghiện Morphine; 2) So với nhóm đối chứng, nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã tăng cao rất rõ và hàm lượng cGMP giảm rất rõ; 3) dùng Cedemex ngắn ngày có thể làm hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã giảm rõ và hàm lượng cGMP tăng lên.

Kết luận: Cedemex có tác dụng ức chế triệu chứng đói thuốc đối với chuột lang cai nghiện Morphine, cơ chế tác dụng do Cedemex tham gia vào điều tiết quá trình sản xuất hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não.

1. VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1. Động vật thí nghiệm: Chuột lang giống SD, chuột đực, nặng trung bình 160g-200g, theo tiêu chuẩn động vật thí nghiệm số SYKG Quế 2003-0005, do trung tâm nuôi súc vật thí nghiện Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc cung cấp.

1.2. Thuốc dùng và thuốc thử:

- Thuốc Cedemex do Viện Nghiên cứu điều trị các bệnh hiểm nghèo, Hà Nội, Việt Nam cung cấp. Thuốc có dạng viên nang, 500mg. Mỗi khi thực hiện thí nghiệm, tiến hành pha 80 viên/30ml nước muối sinh lý, sau đó thêm đủ 40ml, như vậy đạt nồng độ g/ml. Hỗn dịch này được dùng để cho chuột thí nghiệm uống.

- Morphine chlohydrate do Xí nghiêp dược phẩm số 1 Thẩm dương, Trung quốc sản xuất, theo mã số 20040604.

- Yian koufuye do Xí nghiệp Dược phẩm Thiên đại, Chu hải, Trung quốc sản xuất, theo mã số Z20020032.

- Naloxone  chlohydrate do Công ty Dược phẩm Chích Kiều, Hồ nam, Trung quốc sản xuất theo mã số 20040319.

1.3. Mô hình chuột nghiện Morphine sau 7 ngày thực nghiệm: Trừ 2 nhóm chuột bình thường không cho bất kỳ cái gì ngoài nuôi dưỡng thông thường và nhóm chuột đối chứng được tiêm nước muối sinh lý dưới da, 6 nhóm chuột thí nghiệm đều được cho liều lượng thuốc Morphine tiêm dưới da liều tăng dần theo tài liệu tham khảo số 1. Từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 7, liều lượng thuốc phân biệt tăng dần như sau : 20, 40, 60, 80, 100, 100, 100mg/kg/ngày, mỗi ngày 2 lần.

1.4. Xử lý thí nghiệm đối với các nhóm chuột khác nhau: Từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12, tiến hành xử lý khác nhau với các nhóm chuột khác nhau:

(1)     Nhóm chuột bình thường : cho uống nước muối sinh lý liên tục 5 ngày.

(2)     Nhóm đối chứng: Mỗi ngày cho uống 2 lần hỗn dịch thuốc Cedemex, theo thứ tự liều lượng thuốc cao 2 ngày, trung bình 2 ngày và liều thấp 1 ngày.

Số chuột còn lại sau lần cho Morphine sau cùng, phân biệt chia thành 6 nhóm:

(3)     Nhóm ngừng dùng Morphine: cho uống nước muối sinh lý liên tục 5 ngày.

(4)     Nhóm tiếp tục dùng Morphine: Tiếp tục tiêm Morphine với liều lượng 100mg/kg/ngày/5ngày

(5)     Nhóm dùng Cedemex liều cao: 8g/kg/ngày/5ngày.

(6)     Nhóm dùng Cedemex liều trung bình: 4g/kg/ngày/5ngày.

(7)     Nhóm dùng Cedemex liều thấp: 2g/kg/ngày/5ngày

(8)     Nhóm chứng dương tính: Sử dụng thuốc cai nghiện theo hướng dẫn lâm sàng thực nghiệm. Mỗi ngày tiêm thuốc hoặc cho thuốc 2 lần, liên tục 5 ngày theo thứ tự liều lượng thuốc cao 2 ngày, trung bình 2 ngày và liều thấp 1 ngày.

1.5.Theo dõi triệu chứng đói thuốc và lấy mẫu thử nghiệm:

      Vào ngày thí nghiệm thứ 13, tiêm Naloxone vào phúc mạc của tất cả nhóm chuột với liều (4mg/kg) để kích thích trạng thái đói thuốc, ghi nhận các triệu chứng đói thuốc trong vòng 1 giờ và tính điểm (theo phương pháp của tài liệu tham khảo số 2). Sau đó giết chết chuột và mở sọ lấy não bộ, cho vào ống Ependoft, bảo quản  trung thùng ni tơ lỏng ở -80oC.

1.6. Xác định hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não.

Từ mẫu nghiệm trong thùng ni tơ lỏng ở - 80oC, lấy khoảng 50mg tổ chức não, sau khi cân xong cho vào ống có dung tích 10mL, trong ống chứa 2mL dung dịch đệm acetic có nồng độ 50mmol/L (pH4.70). Nghiền đều tổ chức não trong ống và chuyển sang ống khác có chứa 2mL cồn Ethylic 70% để rửa mẫu nghiệm, trộn đều và để yên khoảng 5 phút, ly tâm 3500 vòng/phút/15phút ở 4oC. Tác phần nước nổi cho vào một ống 10mL, phần cặn còn lại thêm 2mL cồn Ethylic 75% để rửa và lại để yên khoảng 5 phút, ly tâm 3500 vòng/phút/15phút ở 4oC. Trộn cả 2 phần nước nổi 2 lần trên, cho vào một ống và đưa vào tủ sấy 60oC làm khô, phần cặn khô còn lại bảo quản ở 4oC để làm thí nghiệm. Xác định hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ theo hướng dẫn của hãng sản xuất, đơn vị là pmol/g tổ chức não.

1.7. Xử lý số liệu thống kê: Dùng phần mềm SPSS11.0, các kết quả thí nghiệm biểu thị bằng trị trung bình (x±s), so sánh các nhóm bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và bảng 2x2.

 

2. KẾT QUẢ

2.1. Tác dụng điều trị của Cedemex với các triệu chứng đói thuốc của chuột nghiện Morphine sau khi tiêm Naloxone.

Sau khi tiêm Nalotone trên các nhóm chuột, các nhóm chuột xuất hiện triệu chứng đói thuốc và giảm thể trọng (p <0,05), điều này khẳng định sự thành công của mô hình chuột thực nghiệm. So với nhóm ngừng dùng Morphine, các nhóm dùng Cedemex liều cao, liều TB và liều thấp, có các triệu chứng đói thuốc ở điểm số thấp hơn, chứng minh được sự giảm triệu chứng đói thuốc của Cedemex ( P<0,05). Nhóm chuột dùng Cedemex liều cao và liều TB còn ngăn cản tốt sự giảm thể trọng của chuột(p< 0,05) (xem bảng 1)

 

 

Bảng 1: Bảng điểm triệu chứng đói thuốc và thể trọng của chuột

các nhóm

điểm triệu chứng đói thuốc

thể trọng trước khi tiêm Nalotone(g)

thể trọng sau khi tiêm Nalotone(g)

tỷ lệ biến đổi( %)

Nhóm bình thường

0

195,25 ± 5,91

194,50±  6,19

0

Nhóm chứng dùng Cedemex

0

210 ±  5,91

211 ± 6,21

0

Nhóm ngừng dùng Morphine

70,25  ± 10,27*

190,75 ±  9,91

178,75 ±12,86

6*

Nhóm tiếp tục dùng Morphine

52,00 ± 4,10*+

188,25 ± 27,04

176,75 ± 22,51

6*

Nhóm  Cedemex liều cao

51,63 ± 3,33*+

183,25 ± 17,73

175,00 ± 15,77

4*+

Nhóm dùng Cedemex liều TB

53,00 ± 5,24*+

206,88± 19,21

196,75 ± 19,16

4*+

Nhóm dùng Cedemex liều thấp

55,54 ± 2,31*+

183,25 ± 17,73

175,00 ± 15,77

5*+

Nhóm chứng dương

53,00  ±10,39*+

206,88 ±  19,21

196,75±   19,16

4*+

So với nhóm bình thường: *p<0,05; so với nhóm ngừng Morphine  +p< 0,05.

2.2. Ảnh hưởng của Cedemex đối với hàm lượng cAMP ở các vùng khác nhau của mô não

      Kết quả thí nghiệm cho thấy, so nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cAMP ở  các vùng ATK, vỏ não và hồi hải mã không có thay đổi. Tuy nhiên, so sánh nhóm ngừng dùng Morphine, nhóm tiếp tục dùng Morphine với các nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cAMP vòng ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã tăng cao hơn (p<0,05) ; nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cAMP ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã tăng cao hơn cả. So với nhóm chuột ngừng dùng Morphine các nhóm chuột dùng Cedemex với các liều lượng khác nhau để cai nghiện thì hàm lượng cAMP ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã đều giảm và sự giảm này đều liên hệ đến liều lượng Cedemex dùng để diều trị ( p<0,05), (xem bảng 2)

Bảng 2: Sự biến đổi hàm lượng cAMP ở các vùng của mô não ở chuột thí nghiệm Morphine

 ( pmol/g)

các nhóm

VTA

Vỏ não

hồi hải mã

Nhóm bình thường

11964,70 ± 321,16

15164,80 ± 347,80

14878,60±  782,91

Nhóm chứng dùng Cedemex

12035 ± 232,14

14892 ±  2347,68

14110 ± 383,29

Nhóm ngừng dùng Morphine

12332,17± 122,75

16062,25 ±  754,65

16427,39 ±667,07

Nhóm tiếp tục dùng Morphine

13155 ± 857,05#*

17923,79± 777,86#*

17576,78 ± 874,05#*

Nhóm  Cedemex liều cao

11216,66± 871,74*

13326,56 ± 688,20*

11761,87 ± 774,28*

Nhóm dùng Cedemex liều TB

11532,66 ± 661,74*

13912,32± 465,32*

13652,18 ± 368,35*

Nhóm dùng Cedemex liều thấp

11716,66± 831,25*

14564,65± 615,20*

15761,87 ± 647,15*

Nhóm chứng dương

11532,66  ±661,74*

13754,16 ±  512,32*

13561,21±   352,24*

So với nhóm bình thường: #p<0,05; So với nhóm ngừng Morphine: *p<0,05

2.3. Ảnh hưởng của Cedemex đối với hàm lượng cGMP ở các vùng khác nhau của mô não

      Kết quả thí nghiệm cho thấy, so nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cGMP ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã không có thay đổi. Tuy nhiên so sánh nhóm ngừng dùng Morphine, nhóm tiếp tục dùng Morphine với các nhóm chuột bình thường và nhóm chuột chỉ dùng Cedemex thì hàm lượng cGMP ở các vùng VTA,vỏ não và hồi hải mã đều giảm đi (p< 0,05); nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cGMP ở các vùng VTA,vỏ não và hồi hải mã giảm nhiều nhất, so với nhóm chuột ngừng dùng Morphine, các nhóm chuột dùng Cedemex với các liều lượng khác nhau để cai nghiện thì có hàm lượng  cGMP ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã đều tăng cao và sự tăng này liên hệ đến liều lượng Cedemex dùng để điều trị (p< 0,05)

Bảng 13: sự biến đổi hàm lượng cGMP  ở các vùng khác nhau của mô não (pmol/g)

các nhóm

VTA

Vỏ não

hồi hải mã

Nhóm bình thường

850,25 ± 74,05

721,56 ± 72,53

635,56±  40,51

Nhóm chứng dùng Cedemex

850,25 ± 39,56

710,33 ±  68,36

626,58 ± 38,64

Nhóm ngừng dùng Morphine

728,71± 11,55#

706,67 ± 16,58#

600,43 ±11,24#

Nhóm tiếp tục dùng Morphine

689,86 ± 53,76#*

604,58± 53,75#*

525,01 ± 7,49#*

Nhóm  Cedemex liều cao

984,32± 12,54*

954,68 ± 22,64*

769,12 ± 22,48*

Nhóm dùng Cedemex liều TB

932,98 ± 15,86*

922,63± 15,75*

719,00 ± 21,36*

Nhóm dùng Cedemex liều thấp

909,50± 17,65*

915,73± 18,57*

669,08 ± 25,84*

Nhóm chứng dương

932,98  ±13,68*

932,51 ±  13,35*

719,00±   23,25*

So với nhóm bình thường : #p< 0,05: So với nhóm ngừng Morphine *p< 0,05

2.4. Sự biến đổi tỷ lệ cAMP /cGMP ở các vùng của mô não ở chuột nghiện Morphine(pmol/g)

       Kết quả thí nghiệm cho thấy, nhóm ngừng dùng Morphine và nhóm tiếp tục dùng Morphine có tỷ lệ hàm lượng cAMP/cGMP ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã của tổ chức não cao hơn so với nhóm chuột bình thường và nhóm đối chứng (p<0,05). Nhóm chuột cai nghiện Morphine bằng Cedemex với các liều khác nhau có tỷ lệ hàm lượng  cAMP/cGMP ở các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã của tổ chức não  hoàn toàn giống với nhóm chuột bình thường và nhóm đối chứng, đồng thời sự phụ thuộc này liên hệ đến liều lượng Cedemex dùng để điều trị (p<0,05).

Bảng 14: Sự biến đổi  tỷ lệ cAMP /cGMP ở các vùng của mô não ở chuột nghiện Morphine

( pmol/g)

 

Các nhóm

VTA

Vỏ não

Hồi hải mã

Nhóm bình thường

14,47 ± 2,36

21,02 ± 0,40

23,41±  2,29

Nhóm chứng dùng Cedemex

14,67 ± 2,33

20,96 ±  0,35

22,52 ± 2,16

Nhóm ngừng dùng Morphine

16,92± 2,33*

24,73 ± 2,35*

27,36 ±1,75*

Nhóm tiếp tục dùng Morphine

19,07 ± 2,36#*

29,65± 4,92*#

33,48 ± 4,16*#

Nhóm  Cedemex liều cao

11,40± 3,58

13,96 ± 4,75

15,29 ± 5,00#

Nhóm dùng Cedemex liều TB

12,36 ± 2,45

15,08± 3,89

18,99 ± 4,58#

Nhóm dùng Cedemex liều thấp

12,88± 3,58

15,90± 4,75

23.56 ± 5,00#

Nhóm chứng dương

12,36  ±2,45

14,75 ±  3,89

18,86±   4,58#

So với nhóm bình thường : #p< 0,05: So với nhóm ngừng Morphine *p< 0,05

 

3. THẢO LUẬN

        cAMP cGMP là những chất trung gian quan trọng trong tế bào, chúng có tác động đến sự điều tiết nhiều chức năng hoạt động của tế bào,. Trong sự chuyển hóa của tế bào, tế bào cơ co rút, vận chuyển điện tử, phân hóa tế bào, sinh trưởng và chết theo chương trình, biểu đạt tính đi truyền, điều hòa nội tiết và phản ứng miễn dịch … đều có tác động của chúng. cAMP và cGMP có lẽ thúc đẩy những quá trình khác nhau của tế bào, hệ thống cAMP thường điều tiết tăng cao để tham gia vào quá trình kết hợp thụ thể của nha phiến (ma túy) và phát triển tính nghiện, đồng thời sau đó cơ thể sẽ phát sinh tính phụ thuộc vào chất gây nghiện để duy trì tình trạng cân bằng mới [4-9].

      Vì vậy, để nghiên cứu cơ chế tác dụng của Cedemex ở mức độ phân tử, chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây nghiện Morphine cho chuột lang sau 7 ngày cho Morphine liều tăng dần, thiết lập mô hình gây nghiện cho chuột lang, sau đó dùng Cedemex với liều cao, liều trung bình và liều thấp để điều trị cai nghiện. Kết quả cho thấy so sánh với nhóm ngừng dùng Morphine, các nhóm dùng liều lượng Cedemex liều cao, liều trung bình và liều thấp có các triệu chứng đói thuốc ở điểm số thấp hơn, chứng minh được sự giảm triệu chứng đói thuốc của Cedemex (p<0,05); Nhóm chuột dùng Cedemex liều cao và liều trung bình còn ngăn cản tốt sự giảm thể trọng của chuột (p<0,05).

   Đồng thời, chúng tôi dùng phương pháp miễn dịch phóng xạ để định lượng cAMP và cGMP trong các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã, kết quả cho thấy:

- Hàm lượng cAMP ở chuột nghiện tăng cao, nhưng ở nhóm chuột bình thường lại thấp, hàm lượng này tương quan với điểm số các triệu chứng đói thuốc. Vì vậy, chúng tôi nhận định hàm lượng cAMP cao hơn bình thường có thể là chứng cứ gián tiếp khẳng định sự thành công của mô hình động vật thí nghiệm.

- Nhóm ngừng dùng Morphine và nhóm tiếp tục dùng Morphine đều có hàm lượng cAMP tăng cao, hàm lượng cGMP giảm đi, mặt khác sự biến đổi này rất rõ ở nhóm tiếp tục dùng Morphine, điều này cho thấy nghiện Morphine và ngừng dùng Morphine làm tăng hàm lượng cAMP và giảm hàm lượng cGMP trong tổ chức não; các triệu chứng đói thuốc liên hệ mật thiết với hàm lượng cAMP và cGMP trong não, kết quả này hoàn toàn giống với các nghiên cứu khác [4-9].

      Những biến đổi này là do các trung khu thần kinh đáp ứng do dùng chất gây nghiện nhiều lần thành nghiện. Sự gia tăng hàm lượng cAMP có lẽ là một phản ứng sinh hóa thay thế trong sự hình thành dung nạp hay nghiện ma túy. Mặt khác, hàm lượng cGMP giảm đi chứng tỏ ma túy có tác dụng chính là ức chế sản sinh cGMP. Có nghiên cứu cho rằng những người có hàm lượng cao cGMP trong dịch não thất thì có các triệu chứng đói thuốc nặng hơn, sử dụng chất ức chế (GC) phosphodiesterase có thể làm giảm các triệu chứng đói thuốc của chuột thì nghiệm [10,11]

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: Cedemex có tác dụng kiểm soát các triệu chứng đói thuốc ở chuột lang cai nghiện Morphine. So với nhóm đối chứng, nhóm tiếp tục dùng Morphine có hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã tăng cao rất rõ và hàm lượng cGMP giảm rất rõ. Dùng Cedemex ngắn ngày làm hàm lượng cAMP trong các vùng VTA, vỏ não và hồi hải mã giảm rõ và hàm lượng cGMP tăng lên đến mức bình thường.

Như vậy, Cedemex có tác dụng ức chế triệu chứng đói thuốc đối với chuột lang cai nghiện Morphine, cơ chế ở mức độ phân tử do Cedemex tham gia vào điều tiết sản xuất hàm lượng cAMP và cGMP trong tổ chức não.

Radinervn